Real-time polymerase chain reaction for the qualitative and quantitative detection ofMycoplasma gallisepticum

Abstract

The aim of this study was to evaluate the sensitivity and the detection limit of a real-time polymerase chain reaction (Q-PCR) developed for the qualitative and quantitative detection of Mycoplasma gallisepticum. No cross-reactivity was observed with DNA from other important avian mycoplasmas, including Mycoplasma synoviae and Mycoplasma meleagridis. However, the Q-PCR could not distinguish between M. gallisepticum and Mycoplasma imitans. The Q-PCR had detection limits 10 to 1000 times lower than a conventional commercial PCR method and than culture. The Q-PCR was used quantitatively by incorporating a set of external M. gallisepticum DNA standards, derived from a M. gallisepticum log-phase culture of a known concentration. The number of colony-forming unit equivalents per millilitre in tracheal swabs from experimentally infected birds could be determined from a single sample. The method had good reproducibility and correlated well with standard counting techniques using culture. It can be concluded that the Q-PCR described is suitable for qualitative and quantitative detection of M. gallisepticum in clinical samples. PCR en temps réel pour la détection qualitative et quantitative de Mycoplasma gallisepticum Le but de cette étude a été d'évaluer la sensibilité et les limites de détection du test d'amplification en chaîne par polymérase en temps réel (Q-PCR) développé pour la détection qualitative et quantitative de Mycoplasma gallisepticum (Mg). Aucune réaction croisée n'a été observée avec l'ADN d'autres mycoplasmes aviaires importants, incluant M. synoviae et M. meleagridis . Cependant, le test Q-PCR n'a pas pu différencier Mg de M. imitans. Les limites de détection ont été de 10 à 1000 fois inférieures à celles d'un test PCR du commerce (cPCR) et à la culture. Le test Q-PCR a été utilisé quantitativement en incorporant un set de standards externes d'ADN de Mg dérivé d'une culture de Mg, en phase logarithmique, de concentration connue. Le nombre d'équivalents unité formant colonie/ml dans les écouvillons trachéaux des animaux infectés expérimentalement a pu être déterminé à partir d'un seul échantillon. La reproductibilité de la méthode a été bonne et une bonne corrélation a été observée avec les techniques standard de comptage après culture. Il peut être conclu que le test Q-PCR décrit est approprié à la détection qualitative et quantitative de Mg à partir d'échantillons cliniques. Real-Time-PCR für den qualitativen und quantitativen Nachweis von Mycoplasma gallisepticum Ziel dieser Studie war es, die Sensibilität und die Nachweisgrenze einer für die qualitative und quantitative Bestimmung von Mycoplasma gallisepticum (MG) entwickelten Real-Time-Polymerasekettenreaktion (Q-PCR) zu untersuchen. Mit der DNS anderer wichtiger aviärer Mykoplasmen einschließlich M. synoviae und M. meleagridis wurden keine Kreuzreaktionen beobachtet. Die Q-PCR konnte jedoch nicht zwischen MG und M. imitans unterscheiden. Die Q-PCR hatte eine 10-1000-mal niedrigere Nachweisgrenze als die konventionelle kommerzielle PCR (cPCR) und die kulturelle Nachweismethode. Die Q-PCR wurde zum quantitativen Nachweis genutzt, indem ein Satz externer MG-DNS-Standards aus MG-log-Phasen-Kulturen mit bekannter Konzentration inkorporiert wurde. Die Zahl der Kolonie bildenden Einheiten/ml in Trachealtupfern von experimentell infizierten Tieren konnte in einer einzigen Probe bestimmt werden. Die Methode weist eine gute Reproduzierbarkeit auf und korrelierte mit Standard-Zählverfahren bei der Kultivierungsmethode. Daraus kann geschlossen werden, dass die beschriebene Q-PCR für den qualitativen und quantitativen Nachweis von MG in Untersuchungsproben geeignet ist. PCR a tiempo real par la detección cuantitativa y cualitativa de Mycoplasma gallisepticum El objetivo de este estudio fue el de evaluar la sensibilidad y el límite de detección de una reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real (Q-PCR) desarrollado para la detección cualitativa y cuantitativa de Mycoplasma gallisepticum (Mg). No se observó reactividad cruzada con el ADN de otros importantes micoplasmas aviares, incluidos M. synoviae y M. meleagridis. Aún así, la Q-PCR no pudo distinguir entre Mg y M. imitans. LA Q-PCR presentó límites de detección de 10 a 1,000 veces menores que la PCR comercial convencional (cPCR) y que el cultivo. La Q-PCR se utilizó como método cuantitativo mediante la incorporación de un grupo de ADN de Mg estándares externos, derivados de un cultivo de Mg en fase log, de concentración conocida. El número de de equivalentes de unidades formadoras de colonias/ml en hisopos traqueales de aves infectadas experimentalmente pudo ser determinado a partir de una sola muestra. El método presentó buena reproducibilidad y se correlacionó bien con las técnicas estándares de contaje usadas en cultivos. Se puede concluir que la Q-PCR descrita es útil para la detección cualitativa y cuantitativa de Mg en muestras clínicas.