Assaying Susceptibility of Avian and Other Influenza A Viruses to Zanamivir: Comparison of Fluorescent and Chemiluminescent Neuraminidase Assays

Abstract

Zanamivir has been shown to inhibit both human and avian influenza viral neuraminidases (NAs) and has been approved in several countries for the treatment and prophylaxis of influenza infection. Reliable monitoring of drug resistance is important for assessment of the impact of drug therapy on circulating virus populations. This study compares the current fluorometric (FL) method for evaluating zanamivir susceptibility with a recently developed chemiluminescent (CL) NA activity assay using viruses representative of all nine NA subtypes. The CL assay displayed signal/noise ratios that are 50–100 times greater than those associated with the FL assay. Human H3N2 strains appeared to exhibit greater NA activity relative to avian subtypes with the FL substrate but not with the CL substrate. Additionally, the CL assay remained linear over three orders of magnitude compared to only one order of magnitude for the FL assay. Four of the nine NA subtypes tested in this study displayed slightly higher inhibitor concentration that inhibits 50% of neuraminidase activity values by CL than by FL, while four displayed the opposite effect. Implications for the routine determination of resistance to NA inhibitors are discussed. Determinación de la susceptibilidad de los virus de influenza aviar y otros virus de influenza tipo A al zanamivir: comparación de las pruebas de neuraminidasa de quemiluminiscencia y fluorescencia. Se ha demostrado que el zanamivir es capaz de inhibir la neuraminidasa de los virus de influenza aviares y humanos y su uso ha sido aprobado en varios países para el tratamiento y profilaxis de la infección por influenza. Es importante la implementación de mecanismos de vigilancia para la detección de cepas resistente a la droga y el impacto de las mismas en la población de virus circulantes. Este estudio compara el método de fluorometría (FL), usado actualmente para evaluar la susceptibilidad al zanamivir, con un nuevo método basado en quemiluminiscencia (CL) para la detección de la actividad de la neuraminidasa, mediante el uso de muestras de virus representativas de los 9 serotipos de neuraminidasa. La prueba de CL mostró rangos de señal/ruido 50–100 veces mayores que los obtenidos mediante la prueba de FL. Las cepas del virus del tipo H5N1 aisladas en humanos parecen tener niveles de actividad de la neuraminidasa más altos que los de las cepas aviares cuando se usa la prueba de FL, pero no cuando se usa la prueba de CL. Los resultados de la prueba de CL permanecieron lineares en tres órdenes de magnitud en comparación con un solo orden de magnitud en la prueba de FL. Cuatro de los 9 subtipos de neuraminidasa estudiados mostraron niveles ligeramente más elevados en la concentración de inhibidor-₅₀ en la prueba de CL en comparación con la prueba de FL, mientras que otros 4 subtipos mostraron resultados opuestos. En el estudio se discuten las implicaciones de la determinación rutinaria de la resistencia a los inhibidores de la neuraminidasa. Abbreviations: CL = chemiluminescent assay, FL = fluorescent assay, IC₅₀ = inhibitor concentration that inhibits 50% of neuraminidase activity, MDCK = Madin-Darby kidney cells, MES = 2-(N-morpholino)ethanesulphonic acid buffer, MUNANA = 4-methylumbelliferyl)-N-acetylneuraminic acid, NA = neuraminidase, NI = neuraminidase inhibitor