ABSTRAK Gen Toll-like Receptor 4 (TLR4) adalah salah satu gen yang mengontrol ketahanan ayam terhadap serangan Salmonella sp, melalui respon immun non-specific. Gen ini dapat digunakan sebagai marka genetik pada ayam. Oleh karena itu penelitian ini bertujuan mengevaluasi polimorfisme genetik gen TLR4 pada beberapa jenis ayam (Ayam Tolaki, Ayam Ras pedaging dan petelur). Total sampel sebanyak 126. Penelitian ini melalui 3 tahapan yakni ekstraksi DNA, amplifikasi PCR (dengan ukuran DNA 220 pb pada ekson 2), dan metode RFLP menggunakan enzim MscI. Hasil penelitian menunjukkan gen TLR4 | MscI bersifat polimorfik pada semua jenis ayam. Diperoleh 2 alel (A dan G). Frekuensi alel G (membawa sfat resisten) pada ayam Tolaki, Ras pedaging, dan petelur masing-masing 0.77, 0.87 dan 0.20. Nilaix2menunjukkan genTLR4|MscI berada dalan keseimbangan Hardy-Weinberg dengan Ho dan He 0,31 dan 0,29. Nilai PIC 0,25 termasuk kategori medium. Gen TLR4| MscI dapat digunakan sebagai marka genetik sifat ketahanan ayam Tolaki terhadap infeksi Salmonellasp. Keywords : Polimorfik, Gen TLR4, Salmonella sp., Non-Specific Immune Response