Penelitian ini menggunakan Racangan Acak Lekap (RAL) dengan tiga perlakuan dan enam ulangan. Perlakuan dalam penelitian ini adalah waktu sexing yang terdiri atas 20 menit (W1), 35 menit (W2) dan 50 menit (W3), sedangkan ulangannya adalah penampungan semen sebanyak enam kali. Parameter makroskopis yang diukur meliputi volume, warna, derajat Keasaman (pH), sedangkan parameter mikroskopis meliputikonsentrasi, gerakan massa, persentase motilitas, persentase spermatozoa hidup dan persentase membran plasma utuh serta non return rate.Hasil penelitian menunjukkan bahwa secara makroskopis dan mikroskopis yaitu volume (ml) (5,5 ± 0,53), warna (putih krem), pH (7 ± 0,00), konsentrasi (1185,57± 392,09), persentase motilitas (80 ± 0.0), persentase spermatozoa hidup (94,71 ± 1,38) dan persentase membran plasma utuh (96,14 ± 1,46).Hasil penelitian setelah sexing kualitas spermatozoa tidak menunjukkan perbedaan pada inkubasi yang berbeda baik pada lapisan atas maupun lapisan bawah. Hasil IB menggunakan semen pasca sexing didapatkan non return rate sebesar 79%. Berdasarkan hasil tersebut dapat disimpulkan kualiatas spermatozoa sapi Bali hasil sexing masih layak untuk diinseminasikan pada induk sapi untuk menghasilkan anak ternak. Kata Kunci: Sapi Bali, spermatozoa, kolom albumin, sexing, kualitas