Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh lama penyimpanan semen segar pada media coldbox terhadap motilitas, viabilitas spermatozoa dan pH semen ayam buras. Penelitian ini dilaksanakan pada Bulan Oktober 2020 di Laboratorium Fakultas Pertanian Universitas Timor Kefamenanu Kabupaten Timor Tengah Utara (TTU). Semen ayam yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari 10 ekor ayam buras jantan dengan kisaran umur 2-3 tahun atau dengan panjang taji 2-3 cm. Hal ini sebagai dasar seleksi ternak jantan untuk menghasilkan semen yang berkualitas yang akan dijadikan sebagai bahan penelitian. Penelitian ini menggunakan metode experimen laboratorium dengan rancangan acak lengkap (RAL) yang terdiri dari 4 perlakuan dan 3 ulangan sehingga terdapat 12 unit percobaan yaitu: R1: Penyimpanan semen segar selama waktu (0 jam), R2: Penyimpanan semen segar selama waktu (2 jam), R3: Penyimpanan semen segar selama waktu (4 jam), R4: Penyimpanan semen segar selama waktu (6 jam). Variabel yang digunakan dalam penelitian ini adalah: Motilitas spermatozoa, Viabilitas spermatozoa, pH semen. Data yang diperoleh dianalisis menggunakan Analisis Sidik Ragam uji Duncan. Dengan menggunakan software statistical packge for the social ssciences (SPSS. 20). Hasil penelitian menunjukkan bahwa rata-rata motilitas spermatozoa pada perlakuan R1, R2, R3 dan R4, masing-masing adalah motilitas massa 4±0, 4±0, 4±0 dan 3±0,6. Motilitas individu 80±00, 80±00, 80±00, dan 80±00. Viabilitas 96±02, 94±04, 95±73, dan 91±75. pH semen 8±05, 8±00, 8±05 dan 8±00. Analisis statistik menunjukan bahwa perlakuan berpengaruh nyata pada viabilitas spermatozoa ayam buras. Disimpulkan bahwa spermatozoa ayam buras dapat bertahan hidup selama 6 jam di dalam media simpan coldbox yang berisi es batu.