Brusellosis merupakan penyakit ekonomis pada hewan yang bersifat infeksius dan mudah menyebar. Evaluasi keberadaan reaktor di titik penyebaran seperti RPH penting untuk dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui prevalensi reaktor brusellosis pada sapi di RPH Kota Ambon. Variabel yang diamati yaitu asal sapi, umur, jenis kelamin, dan status kebuntingan. Besaran sampel ditentukan berdasarkan rumus deteksi penyakit dengan tingkat konfidensi 95%, asumsi prevalensi 2%, dan error 0,05. Sebanyak 175 sampel darah diambil untuk pemeriksaan Rose Bengal Test (RBT) dan dikategorikan reaktor jika muncul reaksi aglutinasi pada saat pengujian. Hasil penelitian menunjukkan 10.29% sapi adalah reaktor. Diantara sejumlah sapi yang berstatus reaktor, 55.56% berasal dari Pulau Seram, 88.89% berumur > 1,5 tahun, 66.67% adalah betina, dan 75% positif bunting. Hasil ini perlu divalidasi dengan Complement Fixation Test (CFT) sehingga dapat dipakai sebagai bahan pertimbangan dalam merumuskan program monitoring dan survailans secara berkelanjutan