A dificuldade em produzir clones de Acacia mearnsii por estaquia, em função das baixas taxas de enraizamento, constitui um empecilho para o uso desta técnica. O objetivo deste estudo foi o desenvolvimento de um protocolo de desinfestação para introdução in vitro de segmentos nodais de clones selecionados de A. mearnsii, visando aprimorar o melhoramento genético da espécie para plantios florestais. A desinfestação de propágulos, provenientes de jardim clonal, foi realizada combinando diferentes produtos e concentrações (álcool etílico 70%, hipoclorito de sódio, plant preservative mixture e cloreto de mercúrio), tempo de imersão e tamanho dos segmentos nodais (4 mm e 10 mm). Segmentos nodais de 10 mm responderam melhor ao tratamento de desinfestação, com 80% de sobrevivência, combinando álcool etílico 70%, cloreto de mercúrio a 0,4% e hipoclorito de sódio a 2%.