INTRODUÇÃO: O complexo Mycobacterium avium (MAC) compreende micobactérias de crescimento lento, naturalmente encontradas no meio ambiente, capazes de causar infecções em diversas espécies de seres vivos, incluindo aves, suínos e humanos. Tais infecções podem ser assintomáticas, clinicamente significantes e, em alguns casos, fatais. No entanto, existe a necessidade de se disponibilizarem técnicas que ofereçam uma identificação conclusiva de bactérias estreitamente relacionadas. As técnicas de biologia molecular se apresentam como ferramentas promissoras para uma identificação mais precisa. MATERIAIS E MÉTODOS: Neste trabalho foram avaliados os marcadores moleculares RNAr 16S, hsp65 e rpoB aplicados à distinção de membros do MAC isolados no Laboratório de Micobactérias do Instituto Evandro Chagas. RESULTADOS: Amostras de MAC colhidas em 15 pacientes foram previamente avaliadas pelo método de análise de polimorfismo de fragmentos de restrição do gene hsp65 (PRA-hsp65), que forneceu três diferentes perfis: (I) BstEII: 235/115/100, HaeIII: 145/130/60; (II) BstEII: 235/210, HaeIII: 130/105; e (III) BstEII: 235/210, HaeIII:145/130. Árvores filogenéticas foram construídas após análise do RNAr 16S, em que as amostras foram distribuídas em dois grupos, semelhante ao encontrado na análise de hsp65. Entretanto, os resultados de rpoB foram discordantes daqueles das outras árvores, devido à modificação de topologia. CONCLUSÃO: Os achados deste estudo sugerem que diferentes forças evolucionárias podem estar atuando sobre o gene rpoB, e, desta forma, é necessário que se tenha precaução ao estabelecer esse alvo para fins taxonômicos. Adicionalmente, recomenda-se que mais de um marcador, incluindo o RNAr 16S, seja avaliado para a identificação micobacteriana.