Detection of tularemia agent dna by loop isothermal amplification

Abstract

Туляремия — природно-очаговая зоонозная инфекция, способная вызывать эпидемические проявления чрезвычайного характера. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ Разработка способа выявления ДНК штаммов возбудителя туляремии Francisella tularensis методом петлевой изотермической амплификации (LAMP, loop isothermal amplification). МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Праймеры к выбранным мишеням были рассчитаны с помощью онлайн-программы Primer Explorer 5 и проверены на специфичность с использованием программы BLAST. Праймеры синтезированы фирмой «Синтол», Москва. Выделение ДНК из вакцинного и вирулентных штаммов эпидемически значимых подвидов туляремийного микроба, а также возбудителей других инфекционных заболеваний проводили с использованием коммерческого набора «ДНК-сорб-В» (ООО «ИнтерЛабСервис», Россия). Реакцию амплификации проводили при температуре 63 °C в течение 60 мин (без петлевых праймеров) или 30 мин (с петлевыми праймерами) с предварительным прогревом при температуре 92 °C в течение 2 мин на амплификаторе «Терцик» («ДНК-Технология», Россия) в присутствии термостабильной SD-полимеразы. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В качестве ДНК-мишеней для обнаружения возбудителя туляремии были выбраны последовательности генов, кодирующих кислую фосфатазу A (acpA), белок внешней мембраны (fopA) и участок гена iglC острова патогенности. Из двух комплектов внешних, внутренних и петлевых оригинальных праймеров, синтезированных для каждого выбранного маркерного гена, наборы acpFt101, fopFt132 и iglCFt1 воспроизводимо и специфично выявляли ДНК 100-1000 микробных клеток F. tularensis. Возможность сократить время анализа в два раза появилась за счет введения петлевых праймеров и визуальной детекции продуктов амплификации, окрашенных интеркалирующим красителем SYTO 82, без проведения последующего электрофореза и визуализации геля после окрашивания бромистым этидием. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Предлагается удобный в применении и не требующий сложного оборудования тест для клинической и полевой диагностики возбудителя туляремии.