Produksi benih mentimun dipengaruhi oleh waktu masaknya bunga jantan dan bunga betina. Ketersediaan bunga jantan dan bunga betina juga mempengaruhi hasil benih mentimun. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh waktu penyerbukan dan proporsi bunga jantan dengan bunga betina terhadap hasil dan kualitas benih mentimun. Penelitian dilaksanakan di Desa Tumpuk, Kecamatan Tugu, Kabupaten Trenggalek yang dilakukan pada bulan Februari sampai dengan Mei 2014. Penelitian menggunakan rancangan acak kelompok (RAK) faktorial. Faktor 1 adalah waktu penyerbukan yang terdiri 3 level yaitu (W1) pukul 06.00-07.00, (W2) pukul 08.00-09.00, dan (W3) pukul 10.00-11.00. Faktor 2 adalah proporsi buga jantan dengan bunga betina 3 level yaitu P1 = 1 ♀ : 1 ♂, P2 = 2 ♀ : 1 ♂, dan P3 = 3 ♀ : 1 ♂. hasil penelitian yang dilakukan menunjukkan waktu penyerbukan memberikan pengaruh nyata terhadap jumlah buah panen, bobot buah pertanaman, panjang buah, jumlah benih pertanaman, bobot benih pertanaman, persentase benih bernas, bobot 100 biji, keserempakan perkecambahan, dan daya kecambah. Proporsi bunga jantan dengan bunga betina menunjukkan pengaruh nyata terhadap bobot buah pertanaman, panjang buah, jumlah benih pertanaman, bobot benih pertanaman, persentase benih bernas, bobot 100 biji, keserempakan perkecambahan, dan daya kecambah. Interaksi nyata antara proporsi bunga betina dengan bunga jantan dan waktu penyerbukan ditunjukkan pada diameter buah dan jumlah benih pertanaman. Kata kunci: Mentimun, Waktu Penyerbukan, Rasio Bunga Jantan-betina, dan Kualitas Benih.