Penelitian ini bertujuan untuk: 1) mengembangkan multimedia interaktif yang layak digunakan dalam pembelajaran biologi; 2) mengetahui kualitas multimedia interaktif hasil pengembangan ditinjau dari aspek kelayakan isi, bahasa dan gambar, penyajian dan kegrafikaan, menurut ahli materi, ahli media, guru biologi, dan teman sejawat, 3) mengetahui peningkatan motivasi dan hasil belajar siswa setelah menggunakan multimedia interaktif Penelitian ini merupakan Research and Development (R&D) model 4-D yang dimodifikasi menjadi 3-D. Tahapan model 3-D meliputi define (pendefinisian), design (perancangan), dan develop (pengembangan). Penilaian produk dilakukan oleh satu ahli materi yang meliputi aspek kelayakan isi, dan aspek bahasa dan gambar, satu ahli media yang meliputi aspek penyajian, dan aspek kegrafikaan, satu guru biologi, dan tiga teman sejawat yang meliputi aspek kelayakan isi, bahasa dan gambar, penyajian, dan kegrafikan. Subjek ujicoba produk adalah siswa kelas XI SMA N 2 Wates, sembilan siswa untuk ujicoba terbatas, dan 29 siswa untuk ujicoba lapangan. Pengumpulan data dilakukan dengan menggunakan angket, lembar observasi, dan tes (pretest-posttest). Hasil penelitian menunjukkan bahwa: 1) multimedia interaktif yang dikembangkan telah layak digunakan dalam pembelajaran biologi; 2) kualitas multimedia interaktif ditinjau dari aspek kelayakan isi, menurut ahli materi, ahli media, guru biologi, dan teman sejawat memiliki kategori sangat baik; 3) terjadi peningkatan motivasi siswa sebelum dan setelah menggunakan multimedia interaktif dengan nilai rerata angket sebesar 29,34 dan 32,80 serta memiliki kategori sedang dengan nilai gain score sebesar 0,33; dan 4) terjadi peningkatan hasil belajar siswa setelah menggunakan multimedia interaktif dengan kategori sedang dengan rerata gain sebesar 0,42 dan peningkatan 68,97% siswa yang mencapai ketuntasan belajar.