Experimental approaches to creating a tissue-specific matrix for a bioartificial liver

Abstract

Дефицит донорских органов для трансплантации печени при лечении терминальных стадий печеночной недостаточности диктует необходимость разработки альтернативных методов, к которым относятся технологии тканевой инженерии и регенеративной медицины. Целью работы было исследование способности тканеспецифического матрикса из децеллюляризованных фрагментов печени человека (ДФПч) поддерживать адгезию и пролиферацию мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека (МСК ЖТч) и HepG2 в статических условиях и в проточном биореакторе. Материалы и методы. Для децеллюляризации фрагментов (не более 8 мм³) печени человека использовали обработку поверхностноактивными веществами (ПАВ) – додецилсульфатом натрия, Тритоном Х-100 с последующей экспозицией в ДНКазе. Биохимические исследования включали определение количества ДНК в исследуемых образцах. Эффективность отмывки от ПАВ оценивали по цитотоксичности матрикса на культуре фибробластов NIH 3T3. Оценку жизнеспособности и метаболической активности клеток проводили методом прижизненного окрашивания комплексом флюоресцентных красителей LIVE/DEAD ® и PrestoBlue™ (Invitrogen, США). Морфологическое исследование клеточно-инженерных конструкций печени проводили с использованием методов гистологического окрашивания и сканирующей электронной микроскопии с лантаноидным контрастированием. Результаты. Показано, что использованная методика децеллюляризации печени позволяет получать биосовместимый матрикс с остаточным количеством ДНК менее 1%, способный поддерживать адгезию и пролиферацию МСК ЖТч и HepG2. В биореакторе на 7-е сутки культивирования наблюдали образование единого конгломерата матрикса ДФПч с многочисленными группами жизнеспособных клеток с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением. Содержание мочевины в культуральной среде превышает значение для образцов, полученных в статических условиях, и составляет 1,5 ± 0,1 ммоль/л, что свидетельствует о метаболической активности HepG2 в составе полученных культуральных систем. Показано, что постоянный поток культуральной среды перфузионного биореактора способствовал росту пролиферативой активности HepG2 и позволил обеспечить более равномерную колонизацию клетками матрикса по сравнению со статическими условиями культивирования. Заключение. Найдены условия равномерного заселения ДФПч в проточном биореакторе клеточными культурами. Способность матрикса поддерживать адгезию и пролиферацию МСК ЖТч и HepG2 в течение 11 суток свидетельствует о возможности его использования в тканевой инженерии печени.