Transgenesis biotechnological procedures influence on domestic duck embryos survival

Abstract

Завдяки високому репродуктивному потенціалу, короткому інтервалу між поколіннями та ембріональному розвитку поза організмом матері, птиця надає унікальні можливості для її використання у фундаментальних та прикладних біологічних дослідженнях. Створення трансгенної птиці ускладнюється будовою її непрозорої яйцеклітини з великим жовтком та унікальною репродуктивною системою цього класу. Пряме мікроін’єкційне введення ДНК в ооцит, яке часто використовують у ссавців, практично неможливе для птахів, оскільки запліднення відбувається в інфудібулюмі репродуктивного тракту і може бути поліспермічним. Тому маніпуляції з зиготою виявилися складними для їх використання при створенні трансгенної птиці. За останні десятиліття були розроблені деякі альтернативні стратегії отримання трансгенної птиці за допомогою химерних тварин, створених шляхом перенесення бластодермальних клітин. Проте на сьогоднішній день ефективність створення трансгенної птиці у багатьох випадках залишається дуже низькою, а техніка використання качок для створення трансгенної птиці практично не розроблена. Бусульфан використовують для пригнічення проліферації клітин. Ін'єкція бусульфану в підембріональну порожнину - один із методів, що збільшує кількість донорських клітин при створенні химер. Однак, до цього часу методи створення герментативних химер качок стикаються з труднощами, пов'язаними зі структурою шкаралупи водоплавних птахів. Тому метою роботи було встановлення дії факторів, які впливають на виживаність трансгенних ембріонів за використання різних методів введення ДНК-конструкції в геном качки. Об’єктами дослідження cслугували качки (Anas platyrhynchos) порід Шанма (Shan partridge duck) та Шаосінь (Shaoxing), що утримуються на качиній фермі Zhuji Guowei Poultry Development Co., Ltd, Китай. Дослідження проводили в лабораторії генетики птиці Чжецзянські Академії аграрних наук та на качиній фермі компанії Zhejiang Generation Biological Science and Technology Co., Ltd. (провінція Чжецзян, КНР). Для аналізу виживаності використовували ембріони, отримані за використання різних методів введення ДНК трансгенної конструкції: 1) пряма ін’єкція ДНК конструкції в підембріональну порожнину; 2) трансфекція ДНК зі спермою; 3) інєкція трансфікованих бластомерів донорів в ембріони реципієнтів після дії бусульфану або ультрафіолету. Всього було досліджено понад 1100 яєць. В результаті дії прямої інєкції ДНК трансгенної конструкції під ембріональну порожнину 300 ембріонів 35,7 % ембріонів не розвивалися після інєкції, 36 % зупинилися в розвитку на момент першої овоскопії (9 день інкубації), 8% загинули в період 10-15 днів, 17,3 % - 16-25 день. Всього після прямих ін’єкцій отримали 9 живих каченят (виживаність склала 3 %), серед яких 4 були трансгенними. Після осіменіння качок трансфікованою спермою на інкубацію було закладено 292 яйця. Після першої овоскопії незаплідненими виявилися 51,4 % яєць; 0,7 % ембріонів зупинилися в розвитку на момент першої овоскопії (9 день інкубації), 1,0 % загинули в період 10-15 днів, 17,8 % - 16-25 день, 6,2 % задохнулися при виводі. Всього після використання трансфікованої сперми отримали 67 живих каченят (виживаність ембріонів від запліднених яєць склала 47,2 %). Серед 31 дорослих тварин 19 були трансгенними. Для стерилізації клітин реципієнта за використання бусульфану у концентрації 300 нг на яйце з...